Микобактерии туберкулеза по цилю нильсену

Диагностика микобактериозов (туберкулеза) птиц

Микобактерии туберкулеза по цилю нильсену

Микобактериозы – группа инфекционных заболеваний человека и животных, включая все виды птиц, вызываемая бактериями рода Mycobacterium.

Хронический дерматит у попугая (Amazon spp.), вызванный Mycobacterium kansasii. источник: «Avian and Exotic Animal Dermatology» Cheryl Greenacre

Большинство видов микобактерий
птиц вызывают хроническую (зачастую без проявления внешней симптоматики в течение длительного периода времени) полиорганную инфекцию с поражением печени, селезенки, легких, кишечника, суставной и костной ткани.

Также процесс может протекать локально, с поражением отдельных участков кожи и прилежащих тканей (чаще в области головы либо конечностей).

Некоторые виды возбудителя являются зооантропонозными, т.е.заразны для животных и человека. К ним относятся в том числе Mycobacterium tuberculosis, M.bovis и M.

avium, вызывающие у людей туберкулёз.

Передача возбудителя может происходить от птицы человеку и наоборот – в равной степени и люди, болеющие туберкулёзом, несут опасность заражения для домашних птиц, проживающих с ними.

Помимо трех вышеобозначенных видов, есть и другие микобактерии (M.fortuitum, M. scrofulaceum, M. intracellulare и др.), встречающиеся у птиц и потенциально опасные для людей.

Чаще они не вызывают системных поражений (тубёркулеза), однако могут провоцировать очаговые хронические дерматиты с образованием абсцессов; главным образом, к группе риска по подобным атипичным микобактериозам относятся дети младшего возраста, пожилые люди, ВИЧ-положительные, онко-больные, а также люди, проходящие химиотерапию или иммуносупрессивную терапию.

Проблема постановки диагноза на микобактериоз и лабораторной диагностики данного заболевания у птиц стоит весьма остро, и на то есть несколько причин:

1. неравномерное выделение возбудителя из организма больного животного – не каждая проба помета может нести в себе микобактерии или содержать достаточное их количество для диагностики. Отсюда вытекает две сопутствующие проблемы:
1.

1 необходимость проведения серий анализов – окраска по Цилю-Нильсену, ПЦР, посевы на питательные среды– для постановки окончательного диагноза;
1.

2 зачастую требуется концентрация микобактерий в материале (методом флотации) перед проведением анализа, что в разы повышает эффективность обнаружения возбудителя при любом методе диагностики (окраске, ПЦР, посевах).

Микроскопия окрашенной по методу Циля-Нильсена мокроты человека, больного туберкулезом: справа на фото материал после концентрации (источник: статья «Методы окраски микроорганизмов» probakterii.ru)

2.

необходимость концентрации материала приводит к последующей сложности: соответствующее оснащение лабораторий для безопасной работы с концентрированным зооантропонозным возбудителем в материале для проведения анализов. Именно за счёт повышенного риска для сотрудников при работе с концентрированными пробами единицы лабораторий (как правило, это государственные лаборатории на базе НИИ) ведут данную деятельность.

Выдержка из статьи «Туберкулез – профессиональное заболевание у медицинских работников» В.В.Косарев, С.А.

Бабанов: «По степени риска заражения туберкулезом медицинские работники распределяются следующим образом: на первом месте — персонал бактерио­логических лабораторий (контакт с больными туберкулезом и живой патогенной культурой); затем — работники стационаров противотуберкулезных учреждений (контакт с больными с лекарственной устойчивостью микобактерий, что подтверждает внутрибольничный путь заражения); … распространенность латентной туберкулезной инфекции крайне высока среди медицинских работников (31,3 %), в особенности среди сотрудников противотуберкулезной службы (49,3 %)…»

[немаловажно: риск заражения владельца прямо пропорционален длительности его проживания с зараженной птицей, т.к.

птица-бактериовыделитель способствует поддержанию высокой, нарастающей концентрации микобактерий в помещении, особенно при отсутствии регулярной уборки со специфическими дез.средствами, т.к.

микобактерии являются кислото-, спирто-, щёлоче-устойчивыми микроорганизмами, длительно сохраняющимися в окружающей среде]

Для диагностики микобактериозов у содержащихся в неволе птиц в России доступны следующие методы:

Окраска по методу Циля-Нильсена:

Материал: помет, мокрота, мазки со слизистых оболочек и из очагов поражения кожи, синовиальная и перитонеальная жидкость, мазки-отпечатки органов при посмертной диагностике.

Принцип метода основан на обнаружении микобактерий при микроскопии материала – в готовом мазке они окрашены в красный цвет красителем фуксином Циля, т.к.являются кислотоустойчивыми, большинство же других микроорганизмов обесцвечивается (на этапе промывания мазка серной кислотой после фуксина) и затем окрашивается в синий (на этапе завершающей окраски метиленовой синью).

Преимущества:Недостатки:
  • экспресс-метод, быстрое получение результата;
  • доступность расходных средств и простота выполнения;
  • относительно высокая чувствительность метода даже при работе без концентрации материала.
  • невозможность определения типа обнаруженных микобактерий;
  • необходима последующая диагностика (ПЦР, посевы) для исключения зооантропонозных видов возбудителя.

Окрашенные по методу Циля-Нильсена помёт жако – слева (более 40 микобактерий в поле зрения микроскопа), помёт сизого голубя – по центру (единичные микобактерии в поле зрения), помёт кореллы – справа (более 100 микобактерий в поле зрения). Фото автора.

При последующей сдаче помёта от данных пациентов на ПЦР-диагностику только от жако с первого же раза была получена положительная ПЦР и подтвержден возбудитель M.bovis.

Две другие птицы прореагировали ложно-отрицательно. Корелла прореагировала положительно при повторной ПЦР по помёту.

Голубь прореагировал ложно-отрицательно при повторной ПЦР по помёту, но диагноз был подтвержден по ПЦР крови.

Пцр (полимеразная цепная реакция):

Материал: кровь, помет, мокрота, мазки со слизистых оболочек и из очагов поражения кожи, синовиальная и перитонеальная жидкость, кусочки органов при посмертной диагностике.

Преимущества:Недостатки:
  • экспресс-метод, быстрое получение результата;
  • возможность определения типа обнаруженных микобактерий при проведении ПЦР на конкретные виды возбудителя: на данный момент в России это возможно для основных зооантропонозных возбудителей – M.tuberculosis, M.bovis, M.avium.
  • условно метод ПЦР-диагностики считается высокочувствительным, на практике же ложно-отрицательные результаты при малом количестве возбудителя в пробе – частое явление, посему требуется серия анализов в нескольких лабораториях;
  • низкая доступность расходных средств и необходимость соответствующего оснащения лаборатории для работы с ПЦР.

Посевы на питательные среды:

Nathan Reading from Halesowen, UK – Mycobacterium kansasii, CC BY 2.0, Рост колоний M.kansasii на среде Левенштейна-Йенсена

Материал: помет, мокрота, мазки со слизистых оболочек и из очагов поражения кожи, синовиальная и перитонеальная жидкость, кусочки органов при посмертной диагностике.

Метод основан на культивировании (высевании) бактерий из материала на специальных питательных средах (наиболее часто используемой является среда Левенштейна-Йенсена), с целью обнаружения роста возбудителя и дальнейшего получения чистой культуры микобактерий для проведения последующей типизации.

Преимущества:Недостатки:
  • возможность определения типа высеенных микобактерий на основнии морфологических и культуральных свойств полученного возбудителя;
  • относительно высокая чувствительность метода даже при работе без концентрации материала.
  • длительность проведения анализа – вплоть до 2-3 месяцев, т.к.микобактерии являются медленнорастущими микроорганизмами;
  • необходимость соответствующего оснащения лаборатории для безопасной работы с чистой культурой возбудителя.

Туберкулинизация (аллерго-диагностика):

Метод основан на выявлении местной аллергической реакции на введение птице внутрикожно туберкулина (готовится из очищенной убитой культуры микобактерий) – положительная реакция обуславливается специфическим иммунным ответом со стороны организма, т.е.свидетельствует об активном взаимодействии возбудителя микобактерий с организмом птицы.

Преимущества:Недостатки:
  • быстрое получение результата (учёт реакции проводится через 24, 48,72 часа после постановки внутрикожной пробы);
  • при положительной реакции точно известен тип возбудителя – M.avium.
  • метод часто дает ложноотрицательный результат, т.к.туберкулин птиц готовится конкретно из культуры Mycobacterium avium, соответственно, специфическая аллергическая реакция будет установлена только для птиц, зараженных типом M.avium;
  • низкая доступность туберкулина птиц в продаже;
  • необходимость наблюдения птицы ветеринарным врачом в течение 3х суток для объективной оценки реакции.

Таким образом, выборочное использование только одного из представленных выше методов для постановки или опровержения окончательного диагноза на микобактериоз у птиц не является объективным.

Необходимо также учитывать, что даже единоразовое получение от обследуемого животного любого положительного результата при любом методе диагностики, является прямым показанием к рассмотрению птицы как подозрительной по микобактериозу, т.е.требующей системного разностороннего подхода к лабораторной диагностике и отбора серии проб в первую очередь для исключения опасности зоонатропонозной инфекции для владельца.

ветеринарный врач Мария Маркина.

заглавное фото: фрагмент картины Louis Edouard Dubufe

Источник: https://birds.vc/bolezni-ptitc/diagnostika-dlya-ptitc/diagnostika-analizi-mikobakterioz-tuberkulez-ptic.html

Анализы на туберкулез

Микобактерии туберкулеза по цилю нильсену

Мокроты больного — это смесь секрета желез слизистой оболочки трахеи и бронхов, серозного выпота из патологически измененных сосудов, иногда частиц казеозных масс, некротической грануляционной и легочной ткани, а также примеси солей. Мокроты выделяется при многих заболеваниях легких и бронхов.

В туберкулезных учреждениях больные собирают мокроту в индивидуальные контейнеры, на четверть емкости заполнены раствором хлорамина, где оно частично дезинфицируется. Контейнеры градуированные, и это дает возможность определять суточное количество мокроты.

Макроскопически у больных туберкулезом легких мокрота имеет слизистый или слизисто-гнойный характер, без запаха, гомогенная, не образует слоев. Количество мокроты может быть разной. В начале заболевания туберкулезом легких мокрота не выделяется, затем оно может выделяться утром отдельными плевками, позже его количество может достигать 100-200 мл.

После макроскопического проводят бактериоскопическое, бактериологическое и биологическое исследование мокроты.

Бактериоскопический метод

Бактериоскопический метод охватывает прямую бактериоскопию мазков из патологического материала, окрашенных по Цилю-Нильсену, бактериоскопию методом флотации, люминесцентную микроскопию, фазовоконтрастного микроскопию.

Бактериоскопическое исследование мокроты начинается с приготовления мазка. Для этого мокроты смешивают с раствором натрия гидроксида и центрифугируют для получения осадка. Осадок стеклянными палочками переносят на предметное стекло.

Вторым предметным стеклом его равномерно размещают: накрывают покровным стеклом. Препарат изучают под микроскопом. В нем можно увидит лейкоциты, эластичные волокна, а при специальной окраске — атипичные клетки и различные бактерии.

Микобактерии окрашиваются по Граму положительно. Для выявления МБТ готовят мазок мокроты высушивают его, фиксируют над пламенем спиртовки, после чего окрашивают по Цилю-Нильсену. Окраска производится сначала карболовым раствором фуксина.

Микобактерии туберкулеза плохо воспринимают окраску, поэтому раствор фуксина наносят на препарат в большом количестве, подогревают над пламенем спиртовки до появления пара. Затем краску сливают, препарат промывают в воде и обесцвечивают в 5% растворе серной кислоты или в смеси этилового спирта с раствором соляной кислоты.

При этом все бактерии и морфологические элементы мокроты, кроме микобактерий туберкулеза, бесцветные. Мазок промывают проточной водой, а затем наносят метиленовый синий на 1-2 мин. После этого раствор краски сливают, мазок промывают и высушивают.

Препарат изучают через иммерсионной систему микроскопа, для чего на препарат наносят каплю иммерсионного масла, чтоб создать одинаковую среду между линзой объектива и препаратом. Микобактерии туберкулеза под микроскопом видно окрашенными в красный цвет.

Метод окраски по Цилю-Нильсену позволяет выявить микобактерии туберкулеза в тех случаях, когда в 1см3 мокроты содержится около 5000 – 10000 МБТ при условии, если просмотрено 300 полей зрения. При небольшом количестве МБТ в мокроте бактериоскопический метод неэффективен.

Исследование мокроты следует проводить в течение трех дней подряд, а при отрицательном результате — применить метод флотации.

Метод флотации

Он основан на том, что при встряхивании двух жидкостей с различным удельным весом легче жидкость всплывает на поверхность одновременно с микобактериями туберкулеза, находящихся в суспензии.

Суть методики заключается в том, что готовят водную суспензию с углеводородами (ксилол, бензол) и МБТ. На поверхность воды утечет сливкообразная пена с МБТ, которую отсасывают пипеткой и наносят на предметное стекло.

Слой пены на предметном стекле высушивают и наносят новый слой пены из колбы. Так наслаивают пену 5-6 раз, после чего мазок фиксируют и окрашивают по Цилю-Нильсену.

Люминесцентная микроскопия

Эффективным методом выявления микобактерий туберкулеза является люминесцентная микроскопия. Суть метода заключается в способности микобактерий туберкулеза, окрашенные специальными красителями (аурамин, родамин), светиться при облучении ультрафиолетовыми лучами.

Преимуществом метода люминесцентной микроскопии является возможность проведения исследований при меньших увеличениях микроскопа, обеспечивает просмотр в короткий срок большего количества полей зрения, чем при обычной микроскопии.

Возможность выявления микобактерий туберкулеза увеличивается на 10-15% по сравнению с обычной бактериоскопии и на 8% – по сравнению с методом флотации.

Используют люминесцентный микроскоп под малым увеличением. На темном фоне видны золотисто-желтые микобактерии туберкулеза.

Фазово-контрастная микроскопия

Это единственный микроскопический метод исследования, позволяющий наблюдать микобактерии и их биологически измененные формы в живом состоянии. Для проведения такого исследования применяют специальное фазовоконтрастное устройство.

При цитологическом исследовании мокроты у больных туберкулезом легких оказывается незначительное количество нейтрофилов в стадии значительной дегенерации на фоне казеозного детрита, скопления мононуклеаров, гигантских клеток Пирогова-Лангханса, иногда эозинофилы.

В случаях, когда мокроты нет или она выделяется в очень малом количестве, больному назначают отхаркивающее микстуру или раздражающие ингаляции. Кроме того, в случаях, когда нет мокроты, исследуют смыв из бронхов.

Исследование смыва из бронхов

Оно проводится врачом. Для этого больному натощак смазывают корень языка, заднюю стенку глотки и надгортанник 1% раствором дикаина. Затем гортанным шприцем вливают в трахею 5-10 мл изотонического раствора натрия хлорида.

У больного сразу возникает сильный кашель и введен изотонический раствор натрия хлорида выкашливается на чашку Петри. Также смыв из бронхов (БАС — бронхоальвеолярный смыв) получают с помощью БАЛ — бронхо-альвеолярного лаважа, который проводят при бронхоскопии. БАЗ исследуют методом флотации или методом посева.

Исследование смыва из бронхов позволяет дополнительно выявлять МБТ в 5-10% случаев.

Исследование мочи, кала, цереброспинальной и плевральной жидкости на МБТ

В клинической практике МБТ нередко приходится проявлять в моче, кале, цереброспинальной и плевральной жидкости. Исследование мочи на МБТ проводят в тех случаях, когда в ходе исследования осадка в каждом поле зрения оказывается не менее 15 лейкоцитов.

Для выявления МБТ мочу многократно центрифугируют, наслаивая каждый раз новые порции с осадка мочи на предметное стекло. Мазок окрашивают по методу Диля-Нильсена. Выявление микобактерий туберкулеза в моче свидетельствует о наличии туберкулеза почек.

Для исследования мочи по методу флотации дают ей постоять, затем 20-30 мл осадка обрабатывают, как обычно, без подогрева на водяной бане. Отсутствие МБТ в гнойной мочи и это не исключает наличия туберкулеза почек. В таких случаях нужно или делать ее посев на питательные среды, или применять биологический метод исследования.

Исследование кала на МБТ следует проводить в случаях подозрения на туберкулез кишок.

При этом надо помнить, что у больных, выделяющих МБТ и частично заглатывают мокроту, МБТ можно выявить при исследовании кала и за непораженных кишок, поскольку микобактерии туберкулеза устойчивы и не всегда погибают под воздействием пищеварительных соков. В кале больных туберкулезом кишок часто оказывается слизь, кровь и примеси гноя.

Обнаружение МБТ в цереброспинальной жидкости нередко имеет решающее значение в диагностике туберкулезного менингита. Однако бактериоскопическим методом выявить МБТ удается только в 10-20% больных туберкулезный менингит. Исследование проводится по следующей методике.

Пробирку с цереброспинальной жидкостью ставят на 8-10 часов в прохладном месте. Если в ней образуется нежная фибринная пленка (она состоит из клеток и МБТ), ее наносят на предметное стекло и готовят препарат по методу Циля-Нильсена.

В случаях, когда пленка не образуется, препарат готовят из осадка после центрифугирования.

Для выявления МБТ в плевральном экссудате, пунктатах и выделении из свищей готовят препарат так же, как и при исследовании мокроты.

Бактериологическое исследование состоит из посева материала на питательные среды и дифференциации культуры МБТ от кислотоустойчивых сапрофитов.

Этим методом можно обнаружить микобактерии туберкулеза, когда в 1 мл материала находится 20-100 микробных клеток. Пробирки со средой помещают в термостат при температуре 37 ° С.

Первые колонии микобактерий могут появиться на 18-30-й день, а иногда — через 2-3 месяца. Бактериологическое исследование проводят одновременно с бактериоскопическим трижды.

Посев исследуемого материала производится на специальные среды после предварительной обработки. Чаще всего используют такие среды: Левенштейна-Йенсена, Финна-2, Миддлбрука, Огава и др., которые содержат вещества, задерживающие рост посторонних микроорганизмов.

Предварительная обработка патологического материала заключается в уничтожении сопроводительной бактериальной флоры. Посев материала из бронхов, а также посев мочи делают из центрифугата или осадка. При этом мочу, если она не загрязнена, можно не обрабатывать.

Предварительная обработка биологического материала

Для подготовки к посеву мокроты, плеврального экссудата, цереброспинальной жидкости существует несколько методов предварительной обработки.

Метод Мазура заключается в обработке патологического материала 3-4 мл 2% раствором серной кислоты в стерильной пробирке. Пробирку встряхивают в течение 3 мин., после чего материал стерильной платиновой петлей наносят на яичные среды.

Метод Петрова: мокроты обрабатывается 4% раствором гидроксида натрия в течение 15 мин., А затем центрифугируется.

Биологический метод

Это привитие патологического материала животным. Гвинейским свинкам или белым мышам в паховой участок или в брюшную полость вводят исследуемый материал в дозе 2-3 мл. Для этого его сначала обрабатывают 3 8% раствором соляной кислоты, хорошо отмывают (иначе на месте введения может возникнуть некроз тканей, возможна даже смерть животного от воздействия кислоты).

Незагрязненную мочу и СМЖ можно прививать без предварительной обработки. При наличии в патологическом материале вирулентных штаммов МБТ ​​животного заболевают туберкулезом и погибают через 1-2 месяца после заражения. Если МБТ масс ослабленную вирулентность, животное погибает позже или может совсем не погибнуть.

В таких случаях животное забивают, и диагноз устанавливают после вскрытия, макро- и микроскопического выявления туберкулезных бугорков. Диагноз можно поставить на основании прижизненного исследования увеличенного регионариого лимфатического узла или инфильтрата, возникший на месте инокуляции патологического материала.

В последние годы для дифференциации микобактерий используют метод газожидкостной хроматографии, основанный на высокой способности различных соединений (аминокислот, нуклеиновых кислот, жиров, углеводов и т. д.). При этом не исключается этап культивирования возбудителя на питательных средах, что можно отнести к недостаткам метода.

Ускоренные методы поиска микобактерий

К ускоренным методам обнаружения микобактерий принадлежат выявления МБТ с помощью индикаторной пробирки ВВL МОИТ. Рост микобактерий туберкулеза происходит в течение 4-10 суток. Пробирки ВВL МОИТ содержат бульон и флуоресцентное соединение, реагирует на кислород, растворенный в бульоне.

Исходная концентрация кислорода не дает яркого свечения. При поглощении кислорода культурой МБТ наблюдается яркая флуоресценция на дне пробирки. Такой результат считают положительным. Если флуоресценции нет или она незначительна — результат отрицательный.

Показания пробирок учитывают ежедневно, начиная со второго дня инкубации.

В последнее время для диагностики туберкулеза используют иммуноферментные и молекулярно-генетические методы.

Молекулярно-генетические методы

Появились методы идентификации МБТ с помощью моноклональных антител, полученных способом гибридомной технологии. Сейчас существует более 100 моноклональных антител к эпитопам основных антигенов МБТ.

Применение этих антител в иммуноферментном анализе дает возможность очень быстро дифференцировать вид возбудителя, но пока метол используется в научных разработках для идентификации возбудителя туберкулеза, который чаще всего встречается.

Среди молекулярно-генетических методов диагностики туберкулеза чаще всего применяется метод ДНК-зондов и полимеразной цепной реакции (ПЦР).

В основе этих методов лежит принцип комплементарности нуклеотидных оснований в построении двуспиральной молекулы ДНК.

При проведении ДНК-зондирования в случае наличия в пробе исследуемого специфического участка ДНК микобактерий образуется гибрид (двухцепной фрагмент) ДНК исследуемого и ДНК-зонда.

В основе приципа ПЦР лежит многократное увеличение фрагмента ДНК.

Для амплификации (многократного удвоения гена бактерий) требуется наличие двух праймеров (затравок) — небольшого одноцепочечного фрагмента ДНК, что соединяется с комплементарной участком одной из цепей матричной ДНК.

В дальнейшем происходит достройка этой цепи ДНК-полимеразой. Увеличение количества (в 106 раз) фрагмента амплифицируемого оказывается электрофорезом в агаровом геле. Учет результатов реакций осуществляется под пластинами трансиллюминатора в ультрафиолетовом свете,

ДНК-зондирование позволяет проводить определение микобактерий в диагностическом материале в течение 2-4 суток, а ПЦР — за 4-6 ч. с максимально высокой чувствительностью методов — 10-100-1000 клеток в пробе исследуемого.

Источник: https://www.eurolab-portal.ru/encyclopedia/323/48749/

Бактериоскопическое исследование мокроты

Микобактерии туберкулеза по цилю нильсену

Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:

  1. Предметные и покровные стекла.
  2. Шпатели и иглы.
  3. Смесь Никифорова.
  4. Газовая или спиртовая горелка.
  5. Пастеровская пипетка с резиновым баллончиком.
  6. Водяная баня с мостиком.
  7. Иммерсионное масло.
  8. Микроскоп.
  9. Фильтровальная бумага.
  10. Пинцеты Корне.
  11. Бумажки Синева.
  12. Основной фуксин.
  13. 96° этиловый спирт.
  14. Фенол.
  15. Глицерин.
  16. Концентрированная соляная кислота.
  17. Метиленовая синька.
  18. Дистиллированная вода.
  19. Генцианвиолет.
  20. Реактив Люголя.
  21. Едкий натр (NaOH).
  22. Бензин или ксилол.

Приготовление препаратов для бактериоскопического исследования

Для бактериоскопического исследования готовят обычно два препарата: один для обнаружения микобактерий туберкулеза и другой для обнаружения прочих микроорганизмов.

Для первого препарата отбирают те же частицы, которые были предназначены для микроскопии, для второго — гнойные частицы.

Взятый материал распределяют по предметному стеклу до получения достаточно тонкой ажурной сеточки (материал на первом стекле распределяют на 2/3 его поверхности, на втором — в центре).

Оба препарата фиксируют троекратным проведением над пламенем горелки. Первый препарат окрашивают по Цилю — Нильсену, второй — по Граму.

Окраска по Цилю-Нильсену

Для окраски препаратов по Цилю-Нильсену необходимы следующие краски и реактивы:

  1. Фуксин Циля: основного фуксина 1 г, глицерина 4 капли, этилового спирта 96° 10 мл, карболовой кислоты (5% раствор фенола) 5 мл, дистиллированной воды 90 мл. К фуксину, помещенному в фарфоровую ступку, прибавляют глицерин, хорошо растирают, постепенно приливают карболовую кислоту, спирт и воду. Фильтруют.
  2. 3% раствор солянокислого спирта: 3 мл концентрированной соляной кислоты удельного веса 1,19 и 97 мл 96° этилового спирта.
  3. 0,2 % водный раствор метиленовой синьки — 1 г метиленовой синьки растворяют в 500 мл дистиллирован- вой воды.   

Техника окраски. На фиксированный препарат кладут полоску фильтровальной бумаги (уже и короче предметного стекла), на которую наливают в избытке фуксин Циля.

Затем препарат нагревают до появления паров (достаточно троекратно медленно провести его над пламенем горелки), дают ему остыть в течение 3-5 минут, сбрасывают с помощью пинцета бумажку, промывают препарат водой и наливают на него 3% раствор солянокислого спирта для обесцвечивания на 20 секунд. После этого препарат промывают водой и вновь повторяют обесцвечивание. Материал должен быть серовато-розового цвета. Затем на препарат на 20-30 секунд наливают 1: 500 водный раствор метиленовой синьки, краску сливают, препарат промывают водой и высушивают, установив в вертикальном положении на полоску фильтровальной бумаги.

Высушенный препарат рассматривают под микроскопом с иммерсией, с поднятым конденсором.

В препарате микобактерии туберкулеза (рис. 60) красного цвета, нежные, тонкие, слегка изогнутые, иногда зернистые. Иногда обнаруживают микобактерип туберкулеза в виде так называемых осколков (в составе тетрады Эрлиха).

Рис. 60. Микобактерии туберкулеза в мокроте. 1 – окраска по Цилю-Нильсену, 2 – в люминесцентном микроскопе.

Все остальные элементы, в том числе и другие микроорганизмы, окрашены в синий цвет. С целью обнаружения мпкобактерий туберкулеза препарат тщательно исследуют, продвигая от одного продольного края к другому и поперек мазка.

Во всех сомнительных случаях рекомендуют обработать препараты жавелевой водой
Результат исследования оформляют, используя следующую формулировку: «микобактерип туберкулеза не обнаружены» или «микобактерип туберкулеза обнаружены», и отмечают приблизительное их количество, например, «единичные в препарате», «единичные в поле зрения» и т. д.

В настоящее время находит все большее распространение люминесцентный способ обнаружения микобактерий туберкулеза в мокроте. Микобактерип туберкулеза имеют золотисто-желтое свечение на черном фоне препарата (рис. 60, 2).

В тех случаях, когда количество микобактерий туберкулеза в мокроте незначительно, для их обнаружения применяют метод обогащения (флотация), который состоит в следующем. В бутылку с нешироким горлышком (емкостью 250 мл) помещают 12-20 мл мокроты, добавляют равный объем 0,5% раствора КОН и встряхивают 5-10 минут.

Затем приливают около 10 мл дистиллированной воды и 0,5-1 мл бензина или ксилола, взбалтывают 10-15 минут и доливают дистиллированную воду гак, чтобы горлышко бутылки было заполнено. Смесь оставляют на 1-2 часа до образования на поверхности жидкости сливкообразного слоя.

На два предметных стекла, заранее расположенных на мостике над водяной баней, нагретой до 60-65°, каплями, с помощью пастеровской пипетки, 5-6 раз наносят сливкообразный слой, каждый раз после подсыхания предыдущей капли.

Мазки окрашивают фуксином Циля на водяной бане (без дополнительной фиксации) в течение 10 минут, промывают водой, 3-4 минуты обесцвечивают 3% раствором солянокислого спирта, вновь обмывают водой, докрашивают 0,2% водным раствором метиленовой синьки, высушивают и исследуют под микроскопом.

Окраска по Граму

Для окраски препаратов по Граму требуются следующие краски и реактивы:

  1. Разведенный фуксин Циля (фуксин Пфейффера): 1 часть фуксина Циля + 9 частей дистиллированной воды.
  2. Реактив Люголя.
  3. 1 % спиртовой раствор генцианвиолета — 1 г генцианвиолета растворяют в 100 мл 96° этилового спирта. Этот раствор краски можно заменить бумажкой, приготовленной по методу Синева (белую фильтровальную бумажку пропитывают 1% спиртовым раствором генцианвиолета, затем высушивают и разрезают на мелкие квадратики соответственно размеру мазка).

Техника окраски. На фиксированный препарат накладывают бумажку Синева и смачивают ее водой (при отсутствии бумажки Синева ее заменяют белой фильтровальной бумажкой, на которую наносят несколько капель 1% спиртового раствора генцианвнолета). Через 1-2 минуты бумажку сбрасывают и на препарат наливают 1-2 капли реактива Люголя.

Через 1-2 минуты препарат обесцвечивают 1-2 каплями 96° этилового спирта до появления бледно-серой окраски материала, смывают водой, на 10-15 секунд наносят сруксин Пфейффера, после чего вновь смывают водой и высушивают. В препаратах могут быть обнаружены (рис.

61) стафилококки, стрептококки, диплококки, палочки Пфейффера, спирохеты Плаута-Венсана, актиномицеты и другие микроорганизмы.

Рис. 61. Различные микроорганизмы в мокроте: диплококки (1), палочки Пфейффера (2), стрептококки (3), стафилококки (4), диплобациллы Фридлендера (5), симбиоз Венсана (6), мицелий актиномицет (7).

Обеззараживание мокроты, посуды и предметов, бывших в соприкосновении с ней

После проведенного исследования мокроту сжигают или обеззараживают. Последнее достигается следующими способами: а) автоклавированием в течение одного часа при 1,5 атм.

; б) кипячением в течение одного часа в 1-2% растворе соды; в) обработкой 5% раствором лизола, карболовой кислоты или смесью, состоящей из равных объемов 5% раствора хлорамина и 5% раствора сернокислого аммония, в течение 12-24 часов.

После обеззараживания посуду тщательно моют водой и высушивают.

Металлические предметы (шпатели, иглы) обеззараживают прокаливанием над огнем. Во избежание переноса микроорганизмов из одной порции мокроты в другую шпатель и иглу немедленно прокаливают после отбора соответствующих частиц.

Покровные стекла опускают в небольшую плоскую чашечку с 40% раствором серной кислоты на 12-24 часа. Затем кислоту сливают, а стекла неоднократно промывают водопроводной и дистиллированной водой. Вымытые стекла высушивают и используют для последующих исследований.

Источник: http://ginekolog.my1.ru/publ/klinicheskie_issledovanija/mokrota/bakterioskopicheskoe_issledovanie_mokroty/40-1-0-771

Медицина и здоровье
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: